聚合酶鏈式反應(PCR)樣品作為分子生物學研究的核心材料,其質量直接決定著實驗數據的可靠性與重復性。在進行PCR樣品預處理時,需要遵循嚴格的流程以確保實驗結果滿意。以下是PCR樣品預處理的具體流程:
1. 樣品準備區:這個區域專門用于樣品的準備,包括DNA或RNA的提取。
2. 避免在該區域操作PCR產物和帶有目標序列的DNA克隆。
3. 組織培養物、組織標本和血清樣品在這里進行處理以提取DNA或RNA。
4. 使用專門的工具和移液管,避免交叉污染,大體積樣品用無菌一次性移液管吸取。
5. 所有操作中要戴實驗服和手套,并頻繁更換手套,尤其是在抽提過程中。
6. 實驗服需專門用于樣品準備區并經常清洗。
7. RNAPCR的額外步驟:在處理RNA樣本時,需特別注意防止污染,反轉錄一步可以在樣品準備區進行。UNG技術也可用于防止污染。
8. 前PCR區:此區域用于準備各種反應,必須保持清潔且無污染。使用正壓活塞式移液管,所有試劑都應高壓滅菌并用0.22μm過濾水配制。
9. 試劑操作:確保所用溶液無核酸和核酸酶污染,試劑中加入適量疊氮鈉以抑制微生物生長。試劑配制后分裝保存,并使用一次性滅菌的瓶子和管子。
10. 建立PCR混合物:可以預先配制并分裝保存“主混合物"以簡化實驗,同時設置陰性、弱陽性和強陽性對照來驗證過程的效率和清潔度。
11. 污染控制:使用UNG酶或紫外線技術來減少污染,尤其是由PCR產物引起的污染。
12. 后PCR區:用于反應后的樣品分析,此區域的試劑和儀器僅用于后PCR活動,不能用于前PCR步驟。
確保每個步驟都遵循無菌操作和隔離原則,以最大限度地減少污染風險,從而提高PCR實驗的成功率和數據的可靠性。