熒光定量PCR（qPCR）是一種在DNA擴增反應體系中加入熒光基團，通過實時監測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。熒光定量PCR可以采用兩種主要方法：熒光染料法（如SYBR Green I）和熒光探針法（如TaqMan探針），其中熒光探針法能提供更高的特異性。熒光定量PCR實驗中避免交叉污染是確保實驗結果準確性和可靠性的重要步驟。以下是一些關鍵措施：

一、污染源分析與監測

1、?樣本間污染?

使用帶濾芯槍頭、避免反復吹吸混勻，樣本容器需嚴格密封。實驗前可通過空氣對照（開蓋暴露1小時）監測環境氣溶膠污染。

2、?試劑與設備污染?

每批次試劑設置陰性對照，定期用蒸餾水擦拭加樣槍、離心機等設備表面，通過擴增檢測污染源。

二、分區管理與操作規范

1、?三區分離

l ?試劑準備區?：僅配置PCR試劑，禁止核酸模板進入。

l ?樣本處理區?：獨立完成核酸提取，避免試劑污染。

l ?擴增檢測區?：單向流動設計，防止產物擴散。

2、?耗材與消毒?

使用一次性耗材，實驗臺面每日用紫外線或DNA酶消毒，PCR儀反應孔定期用含30%次氯酸鈉溶液清潔。

三、正確的實驗操作

1、超凈工作臺：

實驗應在超凈工作臺內進行，工作臺內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必需品。

2、更換手套：

實驗過程中應選擇合適尺寸的手套并及時更換，進出不同實驗區域或進行模板操作后應更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區交叉污染。

3、瞬時離心：

裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險。

四、嚴格的實驗室衛生和清潔措施

1、定期清潔：使用消毒劑對實驗室內的表面、實驗臺、儀器和設備進行清潔和消毒。

2、70%乙醇擦拭：在實驗前用70%乙醇擦拭工作臺，減少核酸酶和其他污染物。

五、專用工具和設備

1、專用工具：為每個實驗區域提供專用的工具和設備，避免共用。

2、維護保養：定期維護和保養設備，防止因設備故障引發的污染。?

六、人員培訓

專業培訓：實驗人員應進行專業培訓，熟悉PCR檢測的原理、方法和操作步驟，掌握樣品的提取、凈化和擴增等技術要點，減少人為操作誤差和交叉污染的發生。

通過上述措施可系統性降低交叉污染風險，提高實驗的準確性和可重復性。