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聯(lián)系我們在ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實驗）中，加入底物（如TMB）后，辣根過氧化物酶（HRP）會催化其顯色，顏色深淺與目標物濃度成正比。為確保讀數(shù)時間點一致，必須在顯色達到預(yù)期程度時立即終止反應(yīng)。終止液通常為強酸（如2mol/L H?SO?），通過破壞酶活性實現(xiàn)快速終止。
若在大鼠樣本檢測中漏加終止液，反應(yīng)將持續(xù)進行，導(dǎo)致吸光度（OD值）隨時間不斷升高，且不同孔因加樣順序差異而顯色時間不一，嚴重影響數(shù)據(jù)可靠性。
漏加終止液的具體影響
1、OD值異常升高：未終止的酶反應(yīng)會使底物持續(xù)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致顏色加深，測得的OD值高于真實值。
2、孔間偏差加大：先加底物的孔反應(yīng)時間更長，顏色更深，造成同一板內(nèi)孔間差異顯著，降低重復(fù)性。
3、zui大吸收波長偏移：TMB顯色后呈藍色，zui大吸收峰在~370nm；加入終止液轉(zhuǎn)為黃色后，才在450nm處有zui強吸收。若不加終止液，使用450nm讀數(shù)將偏離峰值，靈敏度下降，無法準確反映濃度變化。
4、標準曲線失準：標準品與樣本反應(yīng)時間不一致，導(dǎo)致擬合曲線偏離，樣本濃度計算錯誤。
以下表格總結(jié)了關(guān)鍵影響：
影響維度 | 具體表現(xiàn) |
信號強度 | OD值持續(xù)上升，高于實際水平 |
數(shù)據(jù)一致性 | 孔間變異增大，重復(fù)性差 |
檢測波長適用性 | 藍色狀態(tài)下zui大吸收不在450nm，導(dǎo)致讀數(shù)不準確 |
定量準確性 | 標準曲線與樣本反應(yīng)時間不匹配，濃度推算偏差 |
實驗可比性 | 不同批次或板間結(jié)果難以比較 |
建議
立即補救：若發(fā)現(xiàn)漏加，應(yīng)盡快補加終止液并立即讀數(shù)，記錄延遲時間，評估數(shù)據(jù)可用性。
嚴格操作流程：使用檢查清單或雙人核對制度，避免遺漏關(guān)鍵步驟。
設(shè)置對照：每次實驗包含空白對照和陽性對照，有助于識別異常情況。
培訓規(guī)范：對新手進行標準化操作培訓，強調(diào)終止液的關(guān)鍵作用。
