細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

中文名稱：type II CDK2抑制劑(K03861)

英文名稱：K03861

產品規格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg|50mg

產品貨號：BJ-01X8187

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

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type II CDK2抑制劑(K03861)DAB顯色試劑盒黃色(IHC)  1Kit  DAB Peroxidase Substrate Kit for IHC (Yellow Color)50T 水痘帶狀皰疹病毒PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

BCIP/NBT顯色試劑盒藍紫色(IHC)  1kit  BCIP/NBT Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit For IHC1 mg SB203580（p38 MAPK抑制劑） Cell Apoptosis Inducer and Inhibitor -20℃保存

DAB顯色試劑盒紫藍色(WB)  1KIT  DAB Peroxidase Substrate Kit for Western Blot (Purple-Blue Color)250mL Gelatin Veronal Buffer (GVB)   Gelatin Veronal Buffer (GVB)   常溫保存

DAB顯色試劑盒棕黃色(WB)  1KIT  DAB Peroxidase Substrate Kit for Western Blot (Brown-Yellow Color)10uL AP標記的抗辛抗體 Anti DIG Ab,AP 4℃保存

抗GST標簽瓊脂糖介質  100μl|500μl  Anti-GST Mouse Monoclonal Antibody Agarose Resin2 ug pJRD215 pJRD215 低溫運輸，-20℃保存

抗His標簽抗體瓊脂糖介質  100μl|500μl  Anti-His Mouse Monoclonal Antibody Agarose 醇類中和劑管  9ml*20

抗c-Myc標簽抗體瓊脂糖介質  100μl  Anti-Myc Mouse Monoclonal Antibody Agarose Resin1瓶 M1細胞株 M1 低溫運輸和保存

YT?免疫組化染色二抗稀釋液  100ml  YT? Secondary Antibody Dilution Buffer for ImmunohistochemistryMPC瓊脂培養基 MPC Agar Medium 250g

YT?免疫熒光染色二抗稀釋液  100ml  YT? Secondary Antibody Dilution Buffer for Immunofluorescence5mg 堿性 ( 大腸桿菌 ) Phosphatase Alkaline（E.coli） -20℃保存

YT?免疫染色一抗稀釋液  100ml  YT? Primary Antibody Dilution Buffer for Immunol Staining100mL TB Solution-III   TB Solution-III   常溫保存

YT?免疫染色封閉液  100ml  YT? Blocking Buffer for Immunol Staining5次 包涵體中量純化試劑盒 Inclusion Body Midiprep Kit 常溫保存（和核酸清除劑需要-20℃保存，包涵體溶解液室溫保存）